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叶绿体是植物进行光合作用的细胞器，分布在叶肉细胞内。叶绿体是由被膜、间质和类囊体三部分组成。依据分离所得叶绿体的结构完整程度，大致将叶绿体分成两类，一类为被膜已破碎的叶绿体，称之为破碎叶绿体，它具有光合电子传递、光合放氧和光合磷酸化的功能；另一类为被膜完整的叶绿体，它具有同化二氧化碳的完全的光合作用功能。下面分别介绍这两类叶绿体的制备以及被膜完整度的测定。
一、破碎叶绿体的制备 1.器材与试剂 (1) 器材 普通离心机(最好带有水平离心头)、研钵或电动捣碎器、分光光度计、冰箱、扭力天平、 pH计、量筒、移液管、离心管、脱脂纱布等。 (2) 试剂 ①提取液 O.4 mol/L蔗糖，O.O5 mol/L Tris-HCl(pH 7.6)，0.01mol/L NaCl(简称STN溶液) ②80%的丙酮 2.操作方法 (1)叶绿体制备 取菠菜、豌豆或小麦苗等新鲜叶片，洗净后去除中脉，置于研钵或捣碎器中，加人冰冷的提取液，每10g叶片约加20m1冰冷的STN溶液。用手工研磨或用电动捣碎器捣碎，使叶片捣碎至碎米粒样大小，经过4层纱布过滤，滤液先以200×g离心1min，去除粗粒沉淀，上层液再以1000×g离心3min，倒掉上层液，沉淀为叶绿体。用少量STN溶液悬浮叶绿体，悬浮时可用棉球分散沉淀，并通过棉球吸取，以过滤叶绿体结块，叶绿体悬浮液置于冰浴中备用。 (2)叶绿素浓度测定 取叶绿体悬浮液0.1m1，加4.9 m1 80%的丙酮，摇匀后于1000×g离心2min，上清液置于l cm光径的比色杯，在波长为652nm处的分光光度计上比色。再按下列公式计算：652nm光密度读数(OD值)×50/34.5＝叶绿素mg/ml叶绿体悬浮液。 3.注意事项 (1)提取叶绿体操作都在低温下进行，所用器皿都需预冷。 (2)叶绿体活力会随着离体时间延长而不断下降，因此，操作尽可能迅速，分离工作尽可能在短时间内完成。 (3)破碎的叶绿体制剂储存在液氮中，其Hill反应活性可保持较长时间，储存时叶绿体的浓度宜浓些(约3～4mg叶绿素/m1)，并加25%体积的甘油。 二、完整叶绿体的制备 分离方法一般有两种，一是酶消化方法，把叶片表皮撕去后，用纤维素酶和果胶酶消化细胞壁，得到原生质体，再把原生质体通过尼龙网小孔(孔径20μm)，使原生质体破裂而释放出完整叶绿体，但此方法分离得到的叶绿体数量有限。另一种是用机械方法，先用捣碎机破碎叶片，再分步离心，可以大量制备叶绿体。这里主要介绍离心法分离完整叶绿体。 1.器材与试剂 (1)器材 普通离心机(需带有水平离心头)，或低温离心机、电动捣碎器、照光装置、氧电极测氧装置等。 (2)试剂 ①提取液：含0.33mol/L山梨醇，0.05 mol/L MES (pH 6.1)，0.01 mol/L NaCl，2mmol/L MgC12，2 mmol/L EDTA-Na2，0.5 mmol/L KH2P04，2 mmol/L抗坏血酸钠(抗坏血酸钠宜在使用前现配现加) ②涨破叶绿体的Hill反应速率测定液：0.05 mol/L Tris-HCl(pH 7.6)，5 mmol/L MgCl2，10 mmol/L NaCl，10 mmol/L K3Fe(CN)6。10 mmol/L NH4C1 ③0.66 mol/L山梨醇 ④Percoll(一种具有高密度和低渗透势的二氧化硅溶胶) 2.操作方法 (1)采摘新鲜菠菜或豌豆叶片 菠菜要选择嫩而厚，无显著皱纹的叶片，最好在早晨摘取，以免日照后在叶绿体内积累淀粉，不利于完整叶绿体的分离。豌豆也要选择嫩而厚的叶片，摘取后应尽快使用。叶片先在强光下照射15～20min，用以激活叶绿体，尤其用在完整叶绿体的以二氧化碳为底物放氧活性测定时，能使其缩短光合作用诱导期。为了防止强光照射下的温度上升，可把叶片铺放在冰块上，并在光源与叶片之间放隔水层。 (2)叶绿体制备 叶片去除叶柄及中脉后，以每10g叶片约加20～30ml冰冷的提取液。在电动捣碎器上高速捣碎，约2s/次，间隔捣碎3～4次，使叶片碎成绿豆粒样大小，然后经4层纱布过滤，去除残渣。注意过滤时不可用力挤压，以免叶绿体被膜破碎。滤液以1000×g离心，将离心管放人离心机后，使离心机的加速很快上升到预定值，经约30s后再很快使其下降停止，整个离心程序大约用2～3min左右完成。小心地倒出上清液，先用少许提取介质漂洗去沉淀表面的浮物，再加入悬浮介质：即把提取介质中的MES换成HEPES(pH7.6)，悬浮叶绿体，在分散叶绿体沉淀时宜使用毛笔轻轻刷之，或者用手握住离心管，在冰块之间搅动，使叶绿体由于振动而分散开来，不要用棉球吸滤，以防被膜压破。叶绿体悬浮时要浓一些(含叶绿素2 mg/ml以上)，这样有利于其活性的保持。 (3)叶绿体被膜完整率的进一步提高 上述方法所得叶绿体被膜完整率一般约在60%左右，好的时候也可达到70%以上。如果需要进一步提纯，一种简单的方法是再次用悬浮介质洗涤叶绿体，并用同样离心方法沉淀叶绿体，把破碎的叶绿体漂洗去，起着浮选作用，但用此方法提高被膜完整率的程度有限，而且叶绿体损失也多。另一种方法是用Percoll作为密度梯度介质，方法是将3m1含有80% Percoll(以原液为100%浓度，用水稀释)，铺在10ml体积的离心管下层，再把3m1 40%Percoll铺在离心管的中层，然后将lml叶绿体悬浮液轻轻地铺在离心管的上层，用水平离心头的离心机在1500×g下离心2～3min，注意此时离心机的加速一定要缓慢上升，而下降时也要缓慢停下，否则会破坏Percoll的浓度梯度层的形成，取出离心管可以看到有3层绿色带，最上层的为破碎叶绿体，沉在底层的为粗颗粒，而40%～80% Percoll之间的界面上有一绿色层，是完整叶绿体，小心地将它吸取出来，转移到叶绿体悬浮介质里。此部分叶绿体的被膜完整率可达95%以上，有时甚至100%。Percoll介质可以重复使用，把密度梯度离心用过以后的40%和80% Percoll，分别吸取出来，存储于冰箱中以备下次使用。如果制备完整叶绿体的目的只是为了供叶绿体DNA的分离所用，则主要获得被膜完整率高的叶绿体制剂即可，不必考虑叶绿体同化二氧化碳的活性，因此提取介质可改用简单的STN溶液，但是操作顺序需按照制备完整叶绿体的方法，再用Percoll作密度梯度离心提纯。 三、叶绿体被膜完整率的测定 由于铁氰化钾不能透过叶绿体被膜，故完整叶绿体在等渗条件下不能进行铁氰化钾光还原的反应，而被膜破碎的叶绿体，铁氰化钾可进入叶绿体进行反应，利用此原理来比较被膜破碎与未破碎叶绿体的Hill反应速率的差别，就可测出叶绿体中被膜的完整率。被膜未破的叶绿体的Hill反应速率测定，是将上述被膜涨破叶绿体的Hill反应速率测定液，先以1：1体积与0.66 mol/L山梨醇混合，使之保持0.33 mol/L山梨醇浓度，再加入叶绿体(每毫升反应液约含叶绿素50μg)，用氧电极方法测定Hill反应速率(参阅氧电极测氧方法)。被膜破碎的叶绿体Hill反应速率测定，是先与不含山梨醇的Hill反应液混合，使被膜在低渗介质下胀破，再以1：1体积与0.66mol/L山梨醇混合，使测定时也保持0.33mol/L山梨醇浓度，在相同条件下测定Hill反应速率。被膜完整率的计算如下： 被膜完整率(%)＝[（被膜涨破叶绿体的Hill反应速率－完整叶绿体的Hill反应速率）/被膜涨破叶绿体的Hill反应速率 ]×100 测定计算实例见下图：
被膜完整率(%)＝(150－8)/150 ＝94.7% 参考文献 中国科学院上海植物生理研究所，上海市植物生理学会编，现代植物生理学实验指南，1999，北京，科学出版社，1一3 《生物生产力和光合作用测定技术》(科学出版社1986) |
